Infecção de mycobacterium bovis em células fagocíticas: estratégia aplicada ao diagnóstico da tuberculose bovina

Neste trabalho foram estudadas as interacções entre Mycobacterium bovis e células hospedeiras, na perspectiva de aplicar os conhecimentos resultantes desse estudo ao melhoramento do diagnóstico da tuberculose bovina. Foi estudada a dinâmica da infecção de células fagocíticas com estirpes de M. bovis, com ênfase para a invasão e multiplicação intracelular das micobactérias. Avaliações efectuadas por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e contagem de colónias demonstraram que as micobactérias invadiram e replicaram em todos os modelos celulares, sendo que as células epiteliais de pulmão de bovino foram as mais permissivas ao seu crescimento. Foi nas células macrofágicas J774 e THP-1 que se verificaram as maiores concentrações micobacterianas, pelo que foram utilizadas para a detecção e identificação de M. bovis por um método molecular. A optimização da extracção de DNA, por um processo mecânico, e o desenvolvimento do método de PCR-RFLP baseado no gene gyrB, com controlo interno, permitiram a identificação de M. bovis. A sensibilidade deste método foi de 100% quando aplicado a estirpes isoladas e apenas de 40% quando utilizado directamente em amostras de macerados de tecidos de bovinos com tuberculose. Uma pré-incubação (3 dias) das amostras nas culturas celulares contribuiu para melhorar significativamente a sensibilidade (77%) do PCR-RFLP gyrB. A cultura celular, como matriz a ser utilizada para aumentar a quantidade de M. bovis presente em amostras biológicas, revela-se um método promissor para o diagnóstico laboratorial rápido, específico e sensível da tuberculose bovina. ### - Summary - Interactions between Mycobacterium bovis and host cells were studied with the purpose to apply the outcome knowledge in the improvement of bovine tuberculosis diagnosis. The dynamic of infection of four cell models with three strains of M. bovis was evaluated, with emphasis given to the invasion and intracellular multiplication of mycobacteria. Assessments by flow cytometry, fluorescence microscopy and colony counting showed that every cell models permitted the replication of mycobacteria, although bovine lung epithelial cells had been the most permissive one. The highest mycobacteria) load was found, however, in J774 and THP-1 macrophages, and hence these cells were used for the optimization of a molecular method for detection and identification of M. bovis. The optimisation of a DNA extraction step, by a mechanical process, and the development of PCR-RFLP based on gyrB gene, with an internal control, allowed the identification of M. bovis. The sensitivity of this method was 100% when applied to isolated strains and only 40% when directly used on samples of macerated of tissues from cattle with tuberculosis. Assays in which a pre-incubation step (three days) of biological samples in cell cultures was introduced significantly improved the sensitivity (77%) of the gyrB PCR-RFLP. Cell cultures as a support for growth and rapid isolation of M. bovis is a promising method for the specific, sensitive and rapid laboratorial diagnosis of bovine tuberculosis.

Síntese de biguanidas e avaliação da sua atividade biológica em linhas de células tumorais

As biguanidas são um grupo de compostos com diversas atividades biológicas. Recentemente, esta família de compostos tem sido estudada não só pela sua atividade hipoglicemiante, mas também pela sua atividade anti-proliferativa. Um dos objetivos deste estudo foi a síntese de biguanidas, com cadeias laterais com diferentes estruturas e grupos funcionais. O trabalho desenvolvido permitiu a síntese de diversas biguanidas, tendo sido isolados quatro compostos. Outro dos objetivos deste estudo foi avaliar a atividade anti-proliferativa de biguanidas, na linha celular MDST8. Para esse efeito, foi desenvolvido inicialmente um método de quantificação celular com base na atividade ATPásica, testado nas linhas celulares MDST8, MCF7 e BRIN-BD11, tendo sido utilizado como referência a quantificação pelo método das desidrogenases. Os compostos estudados com melhor atividade anti-proliferativa apresentaram IC50 da ordem de 2,5 – 2,9 x10-3 M. Estes valores foram observados em biguanidas cujos grupos substituintes possuíam cadeias hidrocarbonadas cíclicas, alifáticas ou aromáticas p-substituídas, na sua estrutura; Abstract: Synthesis of biguanides and evaluation of their biologic activity in tumor cell lines Biguanides are a group of compounds which have diverse biological activities. Recently, this family of compounds has been studied not only for its hypoglycemic activity, but also for its anti-proliferative activity. One purpose of this study was the synthesis of biguanides, with side chains with different structures and functional groups. The work led to the synthesis of several biguanides, with the isolation of four compounds. Another objective of this study was the evaluation of the anti-proliferative activity of biguanides, in the cell line MDST8. To this aim, it was initially developed a cell quantification method based on the ATPase activity, tested in MDST8, MCF7 and BRIN-BD11 cell lines, with the dehydrogenases method used as reference. The studied compounds with better anti-proliferative activity had IC50 in the range from 2.5 to 2.9 x10-3 M for biguanides whose substituent groups had cyclic hydrocarbon, aliphatic or p-substituted aromatic chains in their structure.